Учёные создали новый метод массовой проверки генов в человеческих тканях
Учёные разработали метод, который позволяет одновременно изучать работу отдельных генов во всём объёме выращенной человеческой ткани. Технология объединяет редактирование генома CRISPR и органоиды — трёхмерные модели мини-органов, созданные из человеческих плюрипотентных стволовых клеток. Новый подход позволил выявить гены, критически важные для формирования нервной системы на ранних стадиях развития эмбриона.
Исследование, опубликованное в журнале eLife, редакция которого назвала работу одним из первых масштабных исследований, раскрывающих механизмы человеческого развития с помощью моделей эмбрионов, было выполнено командой под руководством учёных из Гарвардского университета. Подобные эксперименты на человеке ограничены этическими и техническими нюансами, поэтому исследователи использовали органоиды — структуры, которые способны воспроизводить отдельные этапы формирования тканей в лабораторных условиях.
Главная проблема существующих методов генетического анализа органоидов заключается в неравномерности изменений. При попытке отключить определённый ген только часть клеток получает нужную модификацию, поэтому внутри одного органоида возникает «мозаика» из разных клеточных групп. Это мешает понять, как конкретный ген влияет на развитие всей ткани. Новая технология позволяет подавлять работу отдельных генов сразу во всех клетках органоида.
Для этого команда изменила стандартный процесс подготовки CRISPR-инструментов. Обычно создание нужной генетической конструкции требует нескольких последовательных этапов с выделением и выращиванием отдельных клеточных клонов. Учёные объединили несколько стадий и провели строгую очистку ДНК на раннем этапе, что позволило отказаться от длительного отбора отдельных клонов. Полученные генетические конструкции затем доставлялись в клетки с помощью вирусных носителей.
Дополнительно исследователи оптимизировали производство этих вирусных переносчиков. Они обнаружили, что уменьшение объёма питательной среды при выращивании клеток увеличивает выход вирусных частиц, а добавление вируса одновременно с размещением стволовых клеток на питательной поверхности значительно повышает эффективность доставки генетических конструкций. В результате модификацию получали почти все человеческие плюрипотентные стволовые клетки.
Чтобы проверить возможности метода, учёные выбрали 77 генов и создали на их основе органоиды нервной ткани. Особое внимание они уделили процессу формирования нервной трубки — структуры, из которой во время эмбрионального развития формируются головной и спинной мозг. Нарушение этого этапа может привести к анэнцефалии — тяжёлому врождённому дефекту, при котором головной мозг развивается неправильно.
Анализ показал, что подавление трёх генов — ZIC2, SOX11 и ZNF521 — вызывает выраженные нарушения формирования нервной трубки. В органоидах с выключенными ZIC2 и SOX11 нервная пластинка оставалась полностью открытой, тогда как при снижении активности ZNF521 наблюдались множественные участки неправильного закрытия. Дополнительный анализ показал, что эти гены регулируют не отдельные процессы, а целые группы других генов, участвующих в развитии нервной системы.
По словам авторов, созданная платформа значительно сокращает время и стоимость масштабных генетических экспериментов и позволяет проводить исследования, которые ранее были практически недоступны для человеческих тканей. Новый подход может помочь находить молекулярные причины врождённых нарушений развития и выявлять потенциальные мишени для будущих методов лечения.
