Новая система позволяет точнее отслеживать белки, их взаимодействия и открывает возможности для многоканальной визуализации в клетках
Исследователи из Института дизайна белков Baker Lab, исследовательского кампуса Janelia и Европейской лаборатории молекулярной биологии EMBL Heidelberg разработали новый класс искусственных флуоресцентных белковых меток NovoTags, которые позволяют находить определённые белки внутри человеческих клеток и изучать их взаимодействия с помощью современных методов микроскопии, включая сверхразрешающую. Работа опубликована в журнале Science.
Современные методы визуализации позволяют изучать клетки с высокой детализацией, однако определить расположение отдельных молекул внутри сложной клеточной структуры по-прежнему трудно. Исследователи сравнивают клетку с мегаполисом, где миллионы «жителей-молекул» находятся в постоянном движении, а задача выделить среди них конкретные белки остаётся одной из ключевых проблем клеточной биологии.
NovoTags представляют собой небольшие искусственно созданные белки, которые можно генетически присоединять к исследуемым белкам. После этого они связываются со специальными флуоресцентными красителями Janelia Fluor (JF), благодаря чему отмеченные молекулы становятся видимыми под микроскопом.
Разработанная система расширяет возможности существующих технологий, таких как HaloTag и SNAP-tag, добавляя новые варианты для многоцветной визуализации.
Фото: Steffen Klein / EMBL
Первая группа NovoTag-связывающих белков была разработана для взаимодействия с тремя флуоресцентными красителями, работающими в разных диапазонах видимого спектра. Исследователи показали, что созданные белки способны влиять на оптические свойства красителей, что позволяет управлять характеристиками флуоресцентных меток на уровне молекулярного дизайна.
Затем учёные EMBL разработали расширение системы — NovoSplit. В этой версии белковая метка разделена на 2 части, каждая из которых соединяется с отдельным белком в клетке. Добавление определённого красителя JF работает как «молекулярный переключатель»: оно заставляет 2 части NovoSplit собраться вместе и позволяет исследователям контролировать взаимодействие между белками в заданный момент времени.
Испытания NovoTags и NovoSplit проводились в человеческих клетках с использованием методов STED-микроскопии в реальном времени и флуоресцентной микроскопии FLIM. Комбинация информации о цвете свечения и времени, в течение которого сохраняется флуоресцентный сигнал, потенциально позволяет одновременно отслеживать до 30 различных белков, используя разные комбинации спектральных характеристик и времени флуоресценции.
Разработчики также рассматривают применение NovoSplit в крио-корреляционной световой и электронной микроскопии (cryo-CLEM). Этот метод объединяет изображения одной и той же клетки, полученные с помощью оптической и электронной микроскопии в естественном состоянии, что позволяет одновременно видеть расположение молекул и их ультраструктуру. В EMBL считают, что флуоресцентные cryo-CLEM-метки на основе NovoSplit могут стать инструментом для изучения крупных молекулярных комплексов внутри клеток.
Создание NovoTags стало возможным благодаря специализированной модели искусственного интеллекта для проектирования белков и экспериментальным методам тестирования. Исследователи использовали алгоритмы RFdiffusion для создания белковых структур, LigandMPNN для подбора аминокислотных последовательностей, а затем проверяли кандидаты с помощью AlphaFold, RoseTTAFold и лабораторных методов анализа.
Авторы работы отмечают, что новые метки могут расширить инструментарий клеточной биологии, позволив изучать белки непосредственно внутри живых клеток с большей точностью. Последовательности NovoTags и соответствующие красители уже доступны научному сообществу для дальнейших исследований и разработки новых методов визуализации.
